目前针对视网膜相关疾病的治疗方法仍仅限于解剖学复位和并发症处理，如湿性AMD、 糖尿病视网膜病变患者可接受定期玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)药物或激光光凝治疗，治疗费用高，且效果仅限于延缓视网膜退行性变的进展，不能彻底阻遏疾病进程或逆转疾病结局^[3]。随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术发展，以腺病毒(adeno-associated virus，AAV)或慢病毒作为载体，对先天性黑蒙症患者采用RPE65基因补充治疗，视力改善效果明显，尽管理论上可治愈，但出现术后1~3年视力减退、疾病继续进展等问题，潜在原因包括外源基因未能整合至宿主细胞染色体内、治疗基因的持续性丢失导致蛋白表达量不足以维持生理需要^[6-8]。基因治疗对致病明确的单基因突变型视网膜病变饶有成效，但难以应用于基因和环境复杂作用下产生的AMD、青光眼等疾病，因此退行性视网膜病变治疗方法需要继续创新。细胞替代治疗可以直接补充因病凋亡的视网膜各类型细胞，达到视力改善效果，自从体细胞成功重编程为多能干细胞后，类器官也随之产生，增加了供体来源的渠道，细胞替代治疗研究也迎来新高度。类器官指由干细胞或相关祖细胞发育而来，类似体内器官形成过程，按照细胞分拣并遵循空间上的种系承诺，自发重聚形成包含多种体内器官细胞类型的人工诱导型器官^[9]。RO的产生为研究眼球生物发育机制、眼部疾病建模、药物筛选提供了更好的平台，眼球作为人体免疫豁免器官，移植治疗拥有良好前景，RO衍生的细胞替代治疗也可打破当前移植供体紧缺的僵局，因此本文主要围绕RO应用于在体移植的研究进行综述。

1 视网膜类器官及其衍生物的来源

    类器官(organoid)这一学术名词在早期并非指代体外培养出的生物有机体，而是指畸胎瘤类似体内器官的生长模式或胎儿发育早期未成熟的器官，即形态学上的一种描述^[10-11]。与类器官相似的体外培养可追溯至120年前，Wilson等在当时将分散的海绵细胞在体外培养形成类似海绵的完整重聚有机体，后续有研究^[12-13]也通过细胞悬液体外培养出简单动物——水蛭。随着体外细胞组织培养技术的成熟，类器官也被赋予了新的含义，这种通过体外培养模拟体内组织器官形成过程的创新方式促进了发育生物学的发展，对体外培养的类器官进行动态观察可揭示潜在的发育过程中细胞定向迁移分化的机制，也为体外研究肿瘤及其靶向药提供了新方法。

    RO体外模型由Sasai等首先建立，研究人员对鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell，mESC)使用3D胚胎干细胞培养方法，得到自发形成的眼球前体结构——视杯，且培养过程中细胞迁移及分化与体内基本一致：ESC来源的神经上皮细胞层自发地沿近端-远端轴线形成半球形的囊泡结构，近端部严格分化为RPE，远端部内陷形成胚胎早期的视杯结构^[14]，Nakano等^[15]使用人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESC)体外培养出典型的视杯结构，由于物种差异，hESC来源视杯结构更大，后期视网膜发育成熟后也有更多视锥细胞。Meyer等^[16]首次通过hESC体外培养得到类似于胚胎发育早期视区的细胞(共表达Pax6和Rx)，进而获得视杯样结构，并后续验证了感光细胞、RPE和视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)的存在，但是缺乏发育早期双侧对称的视泡和分化后期完整的视网膜分层结构，推测与其视泡初步形成后被分离移至平面培养基有关，导致正常视网膜的空间立体结构未能形成。在前期研究基础上，脉络膜脑回样萎缩患者的成纤维细胞体外再分化过程中观察到很少的正常RPE细胞，该患者有影响RPE功能的鸟氨酸转氨酶(OAT)A226V型突变，OAT酶活性依赖于维生素B6，反应比色法可以观察到其较正常人RPE的低OAT酶活性，通过添加适量维生素B6和基因修复突变可恢复酶活性^[17]，该研究首次通过药物和基因编辑手段对体外单基因突变的视网膜疾病模型进行干预，并取得较好的效果。

    Sasai等^[14,18]早期在体外使用快速重聚无血清胚状体培养基(quickly aggregated serum free embryonic body，SFEBq)诱导分化出视网膜样结构，但无视网膜分层现象，后续添加Matrigel(由Engelbreth Holm-Swarm肿瘤细胞系分泌富含层粘连蛋白的细胞外基质)的培养基成功诱导出经典的分层视网膜，使用添加laminin、entactin和activin的培养基也有相似效果。Sasai等认为视杯可以在无晶状体或表面外胚层组织的外部条件下自发形成，这种自发的内源性驱动力也被广泛关注，更多结论指向ESC发育为视网膜过程中时间及空间特异性的分子表达及通路调节，如添加nicotinamide、activin A，或使用化学小分子CKI-7和SB431542(或Dkk1、LeftyA)抑 制Wnt和Nodal信号通路，均可使hESC成功向视网膜分化^[19-20]。早期胚胎的视区细胞均表达转录因子Mitf，Mitf阳性的细胞在转录因子Chx10(又名Vsx2)表达后下调Mitf表达水平，从而产生神经视网膜(Pax6和R x双阳性) ^[18,21]。视网膜各亚型细胞的形成同样由多种因子调控， Notch信号通路的抑制可能是影响视网膜分化最早的分子机制，促进视网膜祖细胞(retinal progenitor cell，RPC)有丝分裂阶段后期分化为不同亚型视网膜细胞^[22-23]。增殖期RPC中Vsx2的抑制效应随视网膜发育逐渐减退，原本受Vsx2抑制的转录因子Atoh7/Math5、Mash1/3、NeuroD/Math3、和FoxN4/Ptf1a表达上调，分别促进RGC、双极细胞、无长突细胞和水平细胞的分化^[24-25]， 随后六种主要上调的转录因子(Crx、Otx2、Nrl、Nr2e3、Rorβ、Thrβ2 )相互协调诱导分化出最终的视锥、视杆细胞，成熟的视锥、视杆细胞表达标记蛋白Rhodopsin、Recoverin和S-Opsin^[26-27]。Müller细胞是最后分化的视网膜细胞，延续表达RPC时期的Hes1和Hes5，协同表达Hesr2，终末形态上极其类似RPC，并拥有潜在的神经元再生能力^[23]； RPE 细胞则是视网膜首先分化的细胞，源于早期视杯外层在Chx10下调后Mitf和Pax双阳性的细胞群，由hESC体外培养可在第30天发现拥有显著六边形和色素沉积的RPE，并且表达紧密连接蛋白ZO-1^[16](图1 )。

^{图1 影响视网膜各类型细胞分化过程的潜在分子}

^{Figure 1 Potential molecules affffecting the difffferentiation of multiple retinal cells}

    在体移植的视网膜细胞目前多为感光细胞、RPE，主要由于这两种细胞凋亡是大部分视网膜退行性疾病终末期的共同表现。移植感光细胞早期由ESC体外培养获得，Lamba等^[28-29]采用Noggin和DKK1分别抑制影响前脑形成的BMP、Wnt信号通路，添加胰岛素样因子(IGF-1)，得到hESC来源的感光前体细胞及其它亚型的视网膜细胞，分化第3周可检测到82%的细胞表达RPC相关的Pax6 和Chx10，免疫染色发现12%的 细胞表达RGC和无长突细胞的标记蛋白HuC/D、Neurofilament-M、Tuj1突触相关蛋白，但表达成熟感光细胞标记蛋白S-opsin、rhodopsin的细胞总数不足0.01%，尽管感光前体细胞的标记蛋白Crx和Nrl表达量很高，具有神经元形态的细胞也可有明显的钙电流呈像，但是大部分诱导出的感光细胞不具备内外节，光传导通路的恢复也难以实现，可能由于传统2 D培 养mESC和hESC获取感光细胞难以提供细胞替代治疗所需的足量、成熟的感光细胞。为了更好地体外复现视网膜体内发育模式，获取更多、更成熟的感光细胞以备移植，自Sasai等体外3D培养建立RO以来，由RO获取感光细胞的研究逐渐增多，Gonzalez-Cordero等^[30-31]采用hESC体外3D培养RO，第3~4周出现RPE岛样分布现象，第15周可发现63%的细胞表达视杆细胞相关转录因子Nrl和蛋白rhodopsin(Nrl与Crx早期协同调节rhodopsin蛋白的表达)，第20周同时检测到S型和L/M型视锥细胞，成熟感光细胞分化数目较之前的2D培养结果明显增多；随后不仅在外核层和外丛状层检测到hESC来源感光细胞相应突触蛋白RIBEYE、Syntaxin3，而且在免疫染色和电镜下均观察到：1 )形态良好的内外节，内节胞质处富含线粒体，外节拥有膜盘结构但不够成熟；2 )内外节之间进行蛋白运输的连接纤毛，拥有9+0型微管结构；3)边界明显的外界膜。Zhong等^[32]也通过3D途径诱导分化出感光细胞，并首次利用膜片钳验证RO来源感光细胞的电生理活性。早期多项RO来源细胞移植研究均检测到各亚型视网膜细胞及突触形成的特异性蛋白，但仅少部分研究通过钙离子呈像及膜片钳记录的方式检测到RO来源感光细胞的电信号，且结果差异大^[30-32]。体外诱导分化形态结构发育良好的感光细胞是细胞替代治疗重建视环路的关键，日益完善的3D体外培养可稳定获取数量更多的视锥或视杆细胞^[33]，方便提供后续在体移植所需感光细胞，但供体-受体细胞之间及关联神经元之间电化学信号通路是否得到重建需更全面的验证。

2 视网膜类器官上基因修复

    在RO上首先成功进行基因编辑修复突变的是RPGR基因突变患者来源的RO^[34]。目前应用最广泛的基因编辑工具为成簇规律间隔重复短回文序列/相关蛋白核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9)，由一段20个核苷酸组成的RNA介导识别特定的碱基序列，其设计简单、易于操作，被应用于疾病建模、基因筛选、表观基因修饰、细胞标记和基因治疗^[35-36]。基因治疗与遗传性视网膜退行性疾病息息相关，A AV介导的基因补充治疗在先天性黑蒙患者已有成效，尽管理论上可以纠正遗传性视网膜病变的源头问题，但是由于CRIPR/Cas9潜在的脱靶效应可导致基因组不稳定以及影响正常基因表达，目前仍在动物试验阶段^[37]。由于物种差异，动物模型并不能一致表现人类视网膜病变的特点，如RP2基因突变在人类造成X染色体连锁的视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)，在小鼠并无表型，而RO对视网膜疾病建模更加逼真，视网膜退行性病变的基因治疗也逐渐以RO为模型^[38]。RB1基因调节早期视网膜细胞进入分裂S期导致明显的细胞增殖，缺失RB1则引起各亚型细胞分化障碍，该基因也被认为与视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)直接相关，早期Zheng等[39]体外CRISPR/Cas9敲除RB1后的hESC获取RO并未观察到肿瘤，只有大量凋亡的感光细胞、双极细胞、RGC，将RO移植至免疫缺陷鼠中同样无瘤体产生，Deng等^[40]采用CRIPR/Cas9处理得到RB1纯合突变hiPSC，体外培养成RO也未观察到Rb， 这与RB1突变致病性高不太相符^[41]，推测可能为CRISPR/Cas9未彻底敲除RB1等技术问题。同年Liu等基因敲除RB1，体外首次成功培养出R b模型，得到与X u等相同的结论：Rb起源于视锥前体细胞，并发现异常活跃的PI3K-Akt通路和显著上调的激动因子脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)，这为后续Rb药物筛选提供了更好的高真度肿瘤模型^[42-44]。

    Lane等^[38]对比基因敲除RP2的hiPSC和RP2基因突变患者细胞来源的两种RO，观察到相似的RP视网膜病变：第150天视杆细胞凋亡达到顶峰和第180天RO外核层显著变薄，后续RP2基因补充治疗可逆转上述变化并恢复rhodopsin的 表达 。CRIPR/Cas9基因编辑同样在RPGP突变引起的R P、OPTN(E50K)突变的青光眼等R O疾病模型中获得明显的治疗效果^[34,45-46]。近年来RNA水平剪切修饰异常导致视网膜病变逐渐受到关注，前体mRNA加工因子(pre-mRNA processing factors，PRPFs)被认为可造成常染色体显性RP，RP11型患者(PRPF31突变)来源的R O表现为显著的剪切相关蛋白表达异常，呈现RPE细胞极性混乱、胞吞障碍、跨上皮转运功能失常，同时感光细胞也有进行性损伤和细胞应激反应，经CRISPR/Cas9基因编辑后纠正了原RO所表现的RPE及感光细胞异常^[47]，影响R P相关的mRNA剪切因子还包括PAP1，伴随的下调基因有Fscn2和Bbs2^[48]。探讨多种非编码RNA和相关剪切水平改变，有助于更全面地解释潜在致病机制，方便后续眼科遗传病治疗研究^[49-50]。

    基因编辑与RO应用相辅相成。基因编辑成功在 RO 疾病模型上挽救多种遗传性视网膜病变，为其下一步临床应用打下坚实的基础，而RO经基因编辑能纠正患者来源细胞的基因缺陷，用于后续自体移植，避免常见的免疫排斥反应。

3 视网膜类器官衍生细胞的在体移植

    细胞替代治疗研究发展同步于获取移植细胞方式的变化，从早期ESC到iPSC，从平面培养到3D培养，诱导分化出的视网膜细胞逐渐接近完整的形态结构，但在体移植仍需考虑多方面因素，比如移植细胞的时期、数量等。Kaplan等[51]首次将人源感光细胞膜片移植到晚期R P患者视网膜黄斑下，未系统使用免疫抑制剂条件下，12个月后未观察到任何视力改善，同时也无免疫排斥反应和并发症的发生，提示了同种异源移植的安全性，为实现治疗效果，仍需考虑成熟的外源感光细胞是否有能力与受体视网膜内双极细胞、水平细胞建立突触并且较长时间存活。Maclaren等^[52]认为外源细胞和受体视网膜细胞在发育阶段上差距过大可导致外源细胞不能整合至受体视网膜，并产生畸胎瘤，随之在移植细胞时间窗的选择上做出重要贡献，其研究表明移植分裂期后的感光细胞的前体细胞可成功整合至受体视网膜外核层内，并且通过光诱导电位和瞳孔收缩观察到明显的视功能改善，而移植增殖期干细胞或视网膜祖细胞并不能达成这种效果。多项研究^[30,53-54]后续的结果也表明移植分化时期异质性大的细胞确实可导致畸胎瘤的产生及最终整合的细胞数目显著减少，此后研究也因此多采用分裂后期视网膜前体细胞用于细胞替代治疗(表1)。

3.1 感光细胞在体移植

    3.1.1 感光细胞悬液注射

    早期针对转基因视网膜缺陷小鼠的移植研究多采用玻璃体腔内或视网膜下腔的细胞悬液注射，方便批量操作，并且少有眼内炎发生，如葡萄膜炎、黄斑水肿等^[53]，Maclaren等^[52]多次在小鼠玻璃体腔注射结果显示无整合的感光细胞，视网膜下腔注射更适合感光细胞移植。注射外源感光细胞可导致视网膜下腔出现少量气泡或水泡，Schwartz等^[61]发现移植术后4 h水泡或气泡可完全消失，并未诱发视网膜脱落等并发症。Gonzalez-Cordeo等^[30]采用mESC-RO来源的感光细胞，在RO发育阶段转染载有GFP荧光蛋白的腺病毒AAV，将GFP表达基因插入Rhodopsin基因启动子下游，荧光分选GFP阳性细胞，分别将第2 6、2 9、3 4天的2×105 个视杆前驱细胞悬液注射至Gnat?/? 小鼠视网膜下腔(Gnat负责编码重要的视杆细胞光传导蛋白，敲除后的小鼠用作夜盲症模型)，3周后的结果表明第26、29天移植的外源感光细胞整合数目显著多于第34天移植，Crx在第26天表达减少并伴随Rhodopsin和Recoverin表达上升，而第36天大部分细胞已经表达成熟视杆细胞的标记蛋白α-Transducin和Peripherin-2，可推测第26~29天的培养细胞应处于感光前体细胞阶段^[30,52]。整合的外源细胞拥有内外节，尽管结构相对完整，却未诱导出正常视网膜电图(electroretinography，ERG)，推测主要原因为实际整合至外核层的外源感光细胞数目太少(移植后单眼存活约600个外源感光细胞) ^[30]，并且细胞多聚集于注射点周围，未向周围迁移以达到平均分布。当前外源视杆前驱细胞的移植研究较多，视锥细胞虽然只占鼠感光细胞数目的3%及人感光细胞数目的5%，但功能十分重要，负责日间视觉及色觉，替换少量细胞即可显著改善视觉^[62-63]。Kruczek等^[56,64]通过mESC诱导RO，培养第14~16天加入视黄酸，视锥细胞逐渐增多，但在视杆细胞开始出现时显著减少，使用视黄酸可有效促进感光前驱细胞向视锥细胞发展，第16~18天加入Notch通路抑制剂DAPT，可最多收获约15%的视锥前体细胞，并能在移植后逐渐形态成熟，但欠缺视功能恢复情况的检查。

    为研究晚期视网膜退行性变的细胞替代治疗效果，需要建立晚期视网膜膜退行性变动物模型 ，Prom? / ? 型小鼠模型是现在一种常用于感光细胞移植的轻型视网膜退行性变动物模型，将Prom?/? 型小鼠与rhodopsin基因敲除的tg(Cpfl1；Rho ?/? )转基因鼠杂交得到严重的视网膜退行性变动物模型，mESC-RO培养得视网膜前体细胞，后经磁性激活细胞分选技术(magnetically activated cell sorting，MACS)富集CD73抗体阳性的视杆前驱细胞，将2×105 单位视杆前驱细胞注射至鼠鼻侧视网膜下腔，结果显示外源视杆细胞胞可体定位于内核层，逐渐形成具备内外节的成熟感光细胞形态，且表达光传导通路的蛋白rhodopsin、arrestin-1、transducin及突触相关蛋白synaptophsin、PSD95、pikachurin等，体内存活可达4周，但ERG无反应，可能由于邻近外源视杆细胞的内源水平细胞、双极细胞未重新伸出树突以建立视环路^[55]。正常诱导ERG所需外源感光细胞数目的研究结果各不相同，大部分注射的外源感光细胞数约为2×105 单位，却存在整合的外源细胞数目在15 000和3 000都能够诱导ERG的现象，后续研究应明确诱导ERG反应必需的外源感光细胞数目^[29-30,54]。视网膜下腔注射式移植研究结果异质性较大，但对于功能恢复的试验条件仍有参考意义。

    3.1.2 感光细胞膜片移植

    玻璃体腔或者视网膜下腔注射外源感光细胞常表现为整合的细胞聚集于注射点周围，并不能平均分布于受体视网膜，采用感光细胞膜片移植的方法地可使外源细胞平铺到受体视网膜特定部位。Assawachananont等^[65]在晚期IRD模型鼠中采取细胞悬液移植结果显示外源感光细胞存活时间不超过6个月，并且外源感光细胞形态发育不成熟，后Mandai等^[66]采用RO来源的感光细胞膜片移植至rd1小鼠模型，观察到外源感光细胞形成内外节，与内源水平细胞建立突触连接，且在分化第17天时移植整合效率最佳，外植体存活时间最少6个月。当内源视网膜处于已经严重丢失外核层的致病微环境中，视网膜片移植最大程度上维持了外源感光细胞生存环境的稳定，利于外源感光细胞形态分化成熟。

    Shirai等^[67]首次在视网膜退行性变猴模型上进行视网膜下腔移植hiESC-RO来源的视网膜细胞膜片，外源感光细胞可在体内继续分化出成熟内外节，染色标记水平细胞特定蛋白PKC-α、RIBEYE，可观察到外源感光细胞与受体视网膜内水平细胞建立突触连接，并且比较在分化第50~60、60~70、100天移植的视网膜片，可发现第50~60天的视网膜片移植后可产生更厚的内核层。感光细胞膜片移植方法拥有移植后细胞存活数目多及分化效果好等优点，但移植体较大，创伤可能更多，术后并发症发生概率可比细胞悬液移植更大，需要在手术操作细节上进一步优化，以达到更好的移植效果。